NANOBIOTIX : Article scientifique

Qwest35

09 août 2024 •00:41

La pénétration plus profonde des NP HfO 2 dans le tissu tumoral et une absorption plus élevée des cellules tumorales fournissent une explication mécaniste des excellents effets thérapeutiques en tant que radio-amplificateurs

NANO3

09 août 2024 •01:15

Pour les nostalgiques, il y a presque 14 ans...
13 SEPT 2011 Scientifique Clinique | Nanobiotix Démarre un essai clinique avec son produit leader NBTXR3
Paris, France - 13 septembre 2011
NBTXR3 est une nanoparticule constituée de cristaux
d’oxyde d’hafnium. Une fois injecté dans la tumeur, les nanoparticules s’accumulent dans les
cellules cancéreuses. Grâce aux propriétés physiques de l’oxyde d’hafnium, les particules
émettent des quantités très importantes d’électrons lors de l’exposition aux radiations
ionisantes. Cela provoque la formation de radicaux libres dans la cellule tumorale, qui à leur
tour, endommagent les cellules cancéreuses et provoquent localement leur destruction.
Les nanoparticules NBTXR3 sont inertes et émettent des électrons uniquement pendant leur
exposition à la radiothérapie. En conséquence, la puissance destructrice de la radiothérapie
standard pourrait être localement et sélectivement accrue au sein des cellules tumorales.

Rol21758

09 août 2024 •12:28

Nano3; il ya presque 13 ans, pas 14, tu anticipes quand même un peu, c'est déjà assez long comme cela...

MIKI56

12 août 2024 •11:46

Il est crucial pour comprendre les mécanismes d’action des médicaments de quantifier la distribution tridimensionnelle (3D) des médicaments au sein d’une seule cellule à une résolution nanométrique. Pourtant, cela reste un défi de taille en raison de la résolution latérale limitée, des sensibilités de détection et des problèmes de reconstruction. La méthode préférable consiste à utiliser la tomodensitométrie à rayons X (Nano-CT) pour observer et analyser la distribution des médicaments dans les cellules, mais elle prend du temps, nécessite une expertise spécialisée et est souvent subjective, en particulier avec des nanoparticules métalliques (NP) ultrapetites. De plus, l’exactitude de l’analyse des données par lots par les méthodes de traitement conventionnelles reste incertaine. Dans cette étude, nous avons utilisé des nanoparticules ultra-petites de HfO2 radioamplificateurs comme modèle pour développer une méthode Nano-CT modulaire et automatisée assistée par apprentissage profond pour l'analyse quantitative de localisation de l'absorption de NP métalliques ultra-petites dans les cellules cancéreuses. Nous avons établi une méthode de segmentation d'objets ultra-petits pour les images Nano-CT 3D dans des cellules uniques, qui peut analyser de manière très sensible de minuscules NP et même des NP ultra-petits dans des cellules uniques. Nous avons également construit une méthode d'analyse quantitative de localisation, qui peut segmenter avec précision les particules biodisponibles intracellulaires de celles de l'espace extracellulaire et des composants intracellulaires et des NP. La biodisponibilité élevée des NP HfO2 dans les cellules tumorales, due à une pénétration plus profonde dans le tissu tumoral et à une absorption intracellulaire tumorale plus élevée, fournit un aperçu mécanistique des NP HfO2 en tant que radioamplificateurs avancés en combinant l'analyse quantitative d'images subcellulaires avec les effets thérapeutiques des NP sur les sphéroïdes tumoraux 3D et le cancer du sein. . Nos résultats dévoilent le taux d’absorption important et la quantification subcellulaire des NP HfO2 par la lignée cellulaire du cancer du sein humain (MCF-7). Cette révélation explique le profil notable d’efficacité et d’innocuité des NP HfO2 dans le traitement des tumeurs. Ces résultats démontrent que cette technique d’imagerie 3D promue par l’algorithme d’apprentissage profond a le potentiel de fournir des informations quantitatives de localisation sur les distributions 3D de molécules spécifiques à l’échelle nanométrique. Cette étude propose une approche pour explorer l’analyse quantitative subcellulaire des NP dans des cellules uniques, offrant un outil d’imagerie quantitative précieux pour des quantités infimes ou des NP ultrapetites.

MIKI56

12 août 2024 •11:54

1. Présentation
La radiothérapie (RT) est l'une des modalités les plus efficaces pour le traitement des tumeurs solides primaires et métastatiques, des extensions tumorales microscopiques, ainsi que des ganglions lymphatiques régionaux qui peuvent endommager les cellules en interagissant directement avec des cibles critiques ou indirectement par la production de radicaux libres, comme sous forme de radicaux hydroxyles, ou augmentant la probabilité d'une réponse systémique à l'immunothérapie. (1) Les nanomédicaments (ND), en tant que radioamplificateurs, induisent la mort efficace des cellules cancéreuses en RT et ont attiré une large attention pour le traitement du cancer en raison de l'accumulation de doses de rayonnement et de l'augmentation des effets des rayonnements. (2) Les résultats thérapeutiques des nanoradioamplificateurs (NR) dépendent grandement de la circulation dans la circulation sanguine, de leur accumulation, de leur pénétration dans le tissu tumoral profond et de leur internalisation intracellulaire ultérieure dans les cellules tumorales. (3) Jusqu'à présent, de nombreux efforts ont été consacrés à l'amélioration de la pharmacocinétique, de la biodistribution et de l'efficacité de l'internalisation cellulaire des NR. (4) Cependant, compte tenu du microenvironnement complexe de la tumeur, la distribution intracellulaire et la localisation des NR sont également très importantes pour leur efficacité clinique, avec des résultats thérapeutiques très différents pour les NR adsorbés à la surface cellulaire, internalisés dans la cellule ou localisés sous-cellulaires. Les NR doivent surmonter plusieurs barrières pour induire une mort efficace des cellules cancéreuses, notamment la membrane cellulaire, la dégradation endo/lysosomale, le transport cytoplasmique et le ciblage spécifique des organites. (5) Par exemple, l'acide désoxyribonucléique (ADN) est généralement une cible médicamenteuse en radiothérapie, qui peut induire des cassures simple brin (SSB) et double brin (DSB) et nécessite généralement que les NR soient situés dans des compartiments intracellulaires non attachés à la surface cellulaire ou se répartissent dans l’espace extracellulaire pour faciliter la diffusion des radicaux libres générés à proximité de l’ADN. En outre, la distribution cytosolique des NR peut également augmenter le rapport curatif en endommageant les organites cellulaires, tels que les lysosomes, les mitochondries, les vacuoles et d'autres qui assurent la médiation de la radiorésistance. (5) Ainsi, l’exploration de la distribution intracellulaire tridimensionnelle (3D) et l’analyse quantitative des NR dans les emplacements subcellulaires sont extrêmement importantes pour l’efficacité thérapeutique clinique des tumeurs.

oldi

12 août 2024 •11:58

Ce sont des nanoparticules tellement petites, qu'ils ont un mal fou à savoir ce qu'ils en ont fait.

MIKI56

12 août 2024 •12:00

Les nanoparticules (NP) de HfO2, des ND typiques à base de métal, sont devenues parmi les sensibilisants les plus prometteurs pour la radiothérapie. Le radioamplificateur Nanobiotix 3 (NBTXR3), les NP HfO2 fonctionnels, est actuellement utilisé comme radioamplificateur couramment utilisé pour traiter de nombreux types de tumeurs solides en raison de ses sections efficaces de photoabsorption élevées et de sa sécurité, de sa faisabilité et de son activité clinique acceptables. (6,7) En particulier, NBTXR3 a été approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis pour lancer des essais cliniques de phase 2 à 3 sur la radiothérapie du cancer de la tête et du cou. L'amélioration radio dépend de leur distribution cellulaire et subcellulaire et de l'emplacement du cytoplasme, du noyau, des mitochondries et du réticulum endoplasmique, qui peuvent provoquer des modifications biochimiques cellulaires non identifiées, conduisant à leurs effets radiosensibilisants et synergiques en combinaison avec des rayonnements ionisants. (8) Il est d'une importance capitale de développer des techniques d'imagerie de nanoparticules avec une résolution spatiale isotrope élevée et une localisation quantifiable au niveau cellulaire ou subcellulaire. Cela pourrait fournir des informations sur les voies par lesquelles les nanoparticules pénètrent dans les cellules, leurs cibles intracellulaires et leur efficacité. De plus, cela contribuera à une évaluation plus précise de l’efficacité clinique de NBTXR3. (9)
Pour visualiser la distribution intracellulaire 3D des NP métalliques, une série d'approches ont été développées, comprenant la microscopie électronique à transmission, (10, 11) la spectroscopie de fluorescence, (12) la microscopie Raman confocale (13, 14) et la tomodensitométrie nanométrique (Nano -CT). Parmi eux, la Nano-CT apparaît comme une modalité idéale pour explorer la distribution 3D sur des cellules entières avec une résolution spatiale de 30 nm, offrant la capacité d’imagerie 3D de cellules intactes d’une épaisseur d’environ 10 μm. (15−19) Malgré un certain succès dans la visualisation des NP intracellulaires, des défis importants restent à relever pour obtenir une imagerie 3D quantitative à l'échelle nanométrique via Nano-CT. Le processus de reconstruction d’images repose sur des algorithmes qui prennent en compte l’absorption et la diffusion des rayons par des substances distinctes. Néanmoins, l’équipement CT et les protocoles expérimentaux pourraient introduire divers artefacts et bruits au cours de ce processus de reconstruction. Ces anomalies dans les images peuvent potentiellement déformer ou brouiller la position des NP métalliques, empiétant ainsi sur la précision de l'analyse de la distribution des médicaments dans les cellules. (20,21) Les premières tentatives pour atténuer ces artefacts d’image et ce bruit ont été réalisées grâce à l’utilisation d’algorithmes de filtrage. Cependant, cette approche nécessite souvent des investissements en temps considérables et ne parvient souvent pas à répondre aux exigences de traitement à haut débit dans des scénarios pratiques. (22−24)

MIKI56

12 août 2024 •12:05

La méthode de segmentation d’images par apprentissage profond est une technologie essentielle pour résoudre les problèmes susmentionnés. L'apprentissage de bout en bout évite les erreurs résultant du débruitage et de la segmentation manuels, garantissant ainsi l'exactitude des résultats de segmentation. Les méthodes automatisées sont adaptées pour répondre aux demandes actuelles à haut débit. Récemment, les algorithmes de segmentation d’images d’apprentissage profond ont été largement utilisés dans divers scénarios de segmentation d’images de chimie des matériaux. (25) Par exemple, une méthode non supervisée de tomographie à rayons X à dispersion d'énergie par microscopie électronique à transmission à champ sombre annulaire à grand angle (HAADF-STEM-EDX) a été obtenue en appliquant un réseau neuronal convolutif (CNN). (26) Su et coll. a proposé un codeur-décodeur de profondeur asymétrique CNN pour les ensembles de données sur les matériaux de batterie du monde réel. (27)
Inspirés par ces travaux pionniers, nous avons exploré plus en détail le potentiel de CNN pour la caractérisation structurelle 3D de cellules uniques. Notez que cette analyse s'est principalement concentrée sur l'image Nano-CT des NP dans des cellules ou des tissus dans lesquels certains composants de ces images constituent une fraction relativement faible de l'image globale, ce qui rend l'étiquetage précis une tâche ardue. La segmentation précise des NP au sein des structures 3D est cruciale pour l’analyse quantitative au niveau cellulaire ou subcellulaire, et les algorithmes de segmentation d’images d’apprentissage profond constituent des outils efficaces pour atteindre cet objectif. En exploitant les capacités des méthodologies basées sur l’apprentissage profond et des techniques d’analyse d’images, nous pouvons considérablement amplifier la précision et l’efficacité de la délimitation de la distribution des NP métalliques dans les cellules. Ces stratégies innovantes peuvent traiter des images cellulaires complexes, fournir une résolution et une précision élevées et faciliter l’analyse quantitative ainsi qu’un traitement rapide des données.

MIKI56

12 août 2024 •12:08

Dans cette étude, nous avons proposé une méthode basée sur l'apprentissage en profondeur pour étudier la distribution des ND métalliques dans l'espace tridimensionnel d'une seule cellule et décrire quantitativement divers aspects (Figure 1), notamment la proportion et la profondeur de l'absorption des ND métalliques par les cellules. , à l’aide de quatre indicateurs clés. Nous avons visualisé la distribution intracellulaire 3D des NP HfO2 dans une lignée cellulaire de cancer du sein humain (MCF-7) et quantifié leur profondeur de pénétration dans le site subcellulaire. Les résultats ont révélé que les cellules MCF-7 présentaient un taux d’absorption relativement élevé des NP HfO2, tandis que la profondeur de pénétration des NP dans les cellules était faible. Ceci suggère que les NP HfO2 pourraient minimiser l’impact sur les cellules normales tout en améliorant efficacement la radiothérapie.

MIKI56

12 août 2024 •12:11

Figure 1. Représentation schématique d’un flux de travail systématique qui englobe des expériences cellulaires, des expériences d’imagerie Nano-CT, la reconstruction d’images Nano-CT, la segmentation et l’analyse quantitative de localisation. L'objectif principal est de fournir des informations cruciales sur l'efficacité et la sécurité des NP HfO2 dans le traitement des tumeurs en établissant une compréhension quantitative de leur distribution dans les cellules tumorales MCF-7. Ces efforts analytiques sont renforcés par des méthodologies avancées d’apprentissage en profondeur et des techniques d’imagerie avancées

MIKI56

12 août 2024 •12:13

2. Résultats et discussion
2.1. Construction de la méthode de prétraitement de l’analyse d’images 3D Nano-CT

Les NP HfO2 synthétisées ont été caractérisées en utilisant la microscopie électronique à transmission (TEM), la spectroscopie UV-visible et la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR). Les images TEM montrent que la taille des NP HfO2 était d'environ 2 nm. Les spectres d'absorption UV-visible (Figure S1) ont indiqué un pic caractéristique à 195 nm pour les NP HfO2, révélant une énergie de bande interdite optique de 5,91 eV, ce qui suggère la présence d'une phase monoclinique dans les NP HfO2 synthétisées. Le spectre FTIR des NP HfO2 présentait des pics majeurs à 546, 658 et 750 cm–1, attribués au mode Hf – O des NP HfO2. De plus, les bandes d'absorption à 1 451, 1 523 et 1 630 cm-1 ont été identifiées comme étant C = C et C = O du TPGS, indiquant le succès du revêtement de succinate de polyéthylène glycol de tocophéryle (TPGS) sur la surface des NP HfO2. Grâce à l'expérience CCK-8 (Figure S2), nous avons démontré qu'un dosage de 80 μg/mL est un choix raisonnable pour étudier la distribution intracellulaire des NP HfO2 en utilisant l'imagerie Nano-CT. Ensuite, nous avons réalisé une imagerie Nano-CT unicellulaire sous un microscope de tomographie à rayons X durs (HXT) de la ligne de lumière 4W1A au Centre de rayonnement synchrotron de Pékin (BSRF). Nous avons utilisé MOCUPY pour terminer la reconstruction des images Nano-CT et enregistré les résultats sur 512 tranches. Ensuite, en raison de la diversité inhérente des structures cellulaires, il existe des différences significatives dans la composition cellulaire contenue dans différentes tranches (Figure S3). Ce défi inhérent complique l’annotation précise de régions distinctes et la distribution des NP métalliques dans la cellule. Conscients des attributs de l’image, nous les classons en trois types distincts : ceux contenant tous les composants, ceux dépourvus de noyau et ceux dépourvus à la fois de noyau et de NP HfO2. Nous avons utilisé le modèle de référence U-Net pour mener deux expériences distinctes : la première impliquait de catégoriser les données en trois groupes, puis de segmenter chaque groupe séparément, tandis que la seconde approche impliquait une segmentation directe sans classification préalable. Les résultats expérimentaux, détaillés dans le tableau S1, démontrent que la segmentation des données après catégorisation améliore considérablement les performances de segmentation. Sur la base des résultats ci-dessus, nous avons construit la classe et le segment U-Net (CSUNet) en la combinant avec les modèles de classification et de segmentation pour améliorer la segmentation des images Nano-CT. Veuillez lire la section 2.2 pour plus de détails sur CSUNet.

MIKI56

12 août 2024 •12:17

De plus, dans les cas où la proportion d’un composant spécifique est très infime dans une image, les modèles d’apprentissage profond ont souvent tendance à prédire avec précision les composants les plus abondants tout en ayant du mal à étiqueter avec précision les moins répandus. Cela nécessite un examen préliminaire des données brutes pour optimiser l’analyse ultérieure. Pour atténuer les écarts de données résultant des variations dans les structures cellulaires, nous avons systématiquement organisé et regroupé l'ensemble de données. Plus précisément, nous avons quantifié le nombre de pixels dans diverses régions de chaque image, puis avons retenu sélectivement les images dans lesquelles chaque catégorie cellulaire contenait plus d'une valeur seuil prédéterminée, notée « K ». Cette approche basée sur un seuil a été appliquée à des images de cellules d'une résolution de 512 × 512 pixels. Le modèle d'apprentissage profond a été utilisé pour évaluer différentes valeurs de seuil. Nos résultats ont montré que les résultats optimaux ont été obtenus lorsque K = 300 (Figures 2 et S4). Par conséquent, nous avons sélectionné des images de plus de 300 pixels dans chaque catégorie, conduisant à la projection de 356 images. Parmi celles-ci, 117 images englobaient toutes les composantes ; 152 images manquaient de noyau et 87 images manquaient à la fois de noyau et de NP HfO2.

MIKI56

12 août 2024 •12:19

Figure 2


Figure 2. Filtrage d'un ensemble de données pour la formation en deep learning via le seuil. L'analyse des données montre l'IoU des différents composants de la cellule et l'IoU moyenne de tous les composants, avec une plage seuil de 240 à 350 testée.

2.2. Établissement d'une méthode de segmentation de petits objets pour une image nano-CT 3D dans des cellules uniques

Les modèles d'apprentissage profond ont montré de bonnes performances dans de nombreux scénarios. Nous avons construit CSUNet pour segmenter les images Nano-CT de cellules uniques. Considérant que le modèle dont nous avons besoin nécessite à la fois des modules de classification et de segmentation, nous les avons testés séparément. Premièrement, pour le module de classification, nous avons testé les réseaux de classification classiques VGG19 (28) et ResNet18 (29) et un CNN peu profond, et les résultats expérimentaux (Figure S5) ont prouvé que la tâche de classification est si simple que les réseaux complexes VGG et ResNet sont suréquipés, et donc un CNN peu profond est suffisant pour la classification des images. De plus, nous avons effectué des expériences d'ablation sur ce réseau pour confirmer que la conception du réseau est raisonnable et efficace (figures S6 et S7). Pour le module de segmentation, nous avons principalement testé les performances de segmentation et les performances d'inférence du modèle de segmentation. Nous avons choisi plusieurs modèles de segmentation d'apprentissage profond avec des structures différentes, dont le classique U-Net, DeepLabV3+, (30) Transunet (31) avec transformateur ajouté au modèle U-Net, et SwinUnet (32) entièrement basé sur le transformateur. D'après le tableau S2, nous pouvons voir que les performances de segmentation d'U-Net, Transunet et SwinUnet sont très proches les unes des autres, et en même temps, la consommation de mémoire et le nombre de paramètres d'U-Net sont bien inférieurs à ceux de Transunet et SwinUnet ; par conséquent, U-Net est plus approprié pour être utilisé comme module de segmentation dans cette approche. La structure globale du modèle CSUNet est illustrée à la figure 3. Les images d'entrée ont été classées avant la segmentation, puis un réseau de segmentation U-Net a été sélectionné avec différents paramètres en fonction des résultats de classification pour segmenter les images cellulaires. Pour réduire la complexité de calcul, nous avons réduit le nombre de canaux lors du sous-échantillonnage dans le modèle U-Net. Cette optimisation allège considérablement la charge de calcul tout en maintenant les performances du modèle. En particulier, lors de la formation de CSUNet (Figure S8), nous avons introduit la catégorie d'image correcte lors du calcul de la perte afin de garantir que le modèle puisse utiliser le modèle de segmentation approprié à chaque cycle de formation. Dans le processus de validation, les résultats du modèle de classification sont utilisés pour sélectionner le modèle de segmentation.

MIKI56

12 août 2024 •12:24

Figure 3


Figure 3. Disposition complète du réseau CSUNet. (a) Architecture du module de classification. La réduction d'échelle se produit via une mise en commun maximale entre ces blocs convolutifs, et une mise en commun maximale adaptative est utilisée entre la couche convolutive et la couche entièrement connectée. (b) Les résultats du module de classification et l’image Nano-CT servent d’entrées au module de segmentation. Ce module active et utilise différents modèles U-Net formés pour différentes catégories de résultats.

Pour optimiser simultanément les modules de classification et de segmentation, nous avons construit une fonction de perte hybride adaptée à CSUNet en combinant la perte d'entropie croisée et la perte de dés (équation
1).
MixLoss=CrossEntropyLoss(𝑌̂c,𝑌c)+∑𝑖=13𝑛:1198 94:𝑁DiceLoss(𝑌̂s,𝑌s)
(1)
où Ŷc est la catégorie d'image prédite, Yc est la catégorie d'image réelle, ni est la taille d'échantillon de l'image de classe i, N est la taille d'échantillon de l'ensemble de données, Ŷs est le résultat de segmentation prédit et Ys est le résultat de segmentation réel. Différents poids sont utilisés pour équilibrer les différentes quantités d'intrants de différentes catégories lors du calcul de la perte de dés.
Pour la précision du modèle, nous avons comparé l'intersection de classe sur l'union (IoU), l'intersection moyenne sur l'union (mIoU) et la précision des pixels (PA) des différents modèles. En supposant que k + 1 représente le nombre total de classes, pij représente le nombre total de pixels de la classe de pixels réelle i qui sont prédits comme classe j, et pii représente le nombre total de pixels de la classe de pixels réelle i qui sont prédits comme classe i. ,
alors:
IoU𝑖=𝑝𝑖𝑖∑𝑘𝑗=0𝑝:119894 :𝑗+∑𝑘𝑗=0𝑝𝑗𝑖−𝑝𝑖:11989 4:
(2)
mIoU=1𝑘+1∑𝑖=0𝑘𝑝𝑖𝑖∑:119896 :𝑗=0𝑝𝑖𝑗+∑𝑘𝑗=0𝑝𝑗:119894 :−𝑝𝑖𝑖
(3)
PA=∑𝑘𝑖=0𝑝𝑖:1198 94:∑𝑘𝑖=0∑𝑘𝑗=0𝑝𝑖𝑗
(4)

MIKI56

12 août 2024 •12:26

Dans l'expérience contrôlée, nous avons ajouté les réseaux U-Net, Transunet, DeepLabV3+ et SwinUnet. Nous avons mené des expériences en utilisant l'ensemble de données filtrées. Pour l'évaluation du modèle, 90 % des données ont été désignées au hasard comme données d'entraînement, tandis que le reste constituait des données de validation pour évaluer l'efficacité du modèle. Le modèle CSUNet a largement surpassé les modèles de comparaison en termes de précision de segmentation pour le noyau et les NP HfO2, comme indiqué dans le tableau 1. La technique de segmentation basée sur l'apprentissage profond facilite la différenciation rapide et précise de composants cellulaires distincts. En outre, cela améliore la capacité de discerner la distribution des NP HfO2 au sein de cellules individuelles. La figure S9 illustre des images sélectionnées au hasard parmi les trois ensembles de données distincts ainsi que les résultats correspondants de la segmentation CSUNet. La méthode d'apprentissage en profondeur se rapproche rapidement des étiquettes dérivées d'un petit nombre d'échantillons, éliminant ainsi le long processus d'étiquetage manuel. Cela démontre l'exactitude de CSUNet, atteignant presque la précision de l'annotation manuelle.

MIKI56

12 août 2024 •12:28

2.3. Analyse quantitative de localisation de l'absorption de HfO2 NP par les cellules cancéreuses

Dans les essais cliniques, les NP HfO2 ont démontré des effets radio-renforçants efficaces dans les traitements localisés du cancer de la tête et du cou et du cancer du sein. En particulier, les particules plus petites de 2 à 3 nm se propagent plus profondément dans la tumeur et pénètrent dans les cellules tumorales que les particules plus grosses. (33) Dans cette étude, des NP HfO2 ultra petites (∼ 2 nm) ont été sélectionnées comme modèles, plus propices à la pénétration profonde de la tumeur et à la distribution uniforme des médicaments. Cependant, l’analyse quantitative subcellulaire de ces particules ultrapetites est très difficile en raison de la faiblesse des signaux de réponse. Pour les images de cellules individuelles obtenues par Nano-CT, la segmentation précise des composants cellulaires a été obtenue. Pour mieux comprendre la distribution des NP métalliques dans les cellules cancéreuses, nous avons construit une méthode d'analyse quantitative de localisation contenant quatre perspectives pour analyser l'absorption des NP HfO2 par les cellules cancéreuses. Nous avons adopté une unité statistique fondamentale mesurant 512 × 512 pixels (15 155,2 × 15 155,2 nm, avec une taille de pixel unique de 29,6 nm) pour mener une analyse quantitative de localisation complète de la distribution des NP HfO2 dans les cellules. Dans un premier temps, des masques englobant l'ensemble du noyau et la région cellulaire globale ont été générés à l'aide de l'outil ImageJ (Figure S10). Ces masques ont ensuite été utilisés pour extraire la teneur en NP métalliques de divers segments dans les résultats de segmentation (Figure S11), facilitant ainsi l'analyse quantitative de localisation ultérieure. Ici, pour chaque tranche, nous discutons du nombre de pixels de NP métalliques intracellulaires et extracellulaires, de la densité des NP dans le cytoplasme et le noyau, de la proportion de NP dans la tranche parmi toutes les NP et de la distance entre les NP métalliques dans le cytoplasme et le bord du cytoplasme. Nous avons défini la densité des particules pour mieux caractériser la teneur en NP métalliques dans le noyau ou le cytoplasme comme l'équation 5.
densité de particules = 𝑁particule𝑁total
(5)

MIKI56

12 août 2024 •12:32

Nparticule est le nombre de pixels de NP dans des zones désignées, telles que le cytoplasme et le noyau. NTotal est le nombre total de pixels dans la zone désignée.
La teneur en NP métalliques a été calculée pour les compartiments intracellulaires et extracellulaires de chaque section (Figure 4a). Plus précisément, les sections présentant la plus forte teneur en NP métalliques intracellulaires, indices 94 et 431, ont été mises en évidence. La configuration tridimensionnelle des sections correspondantes est présentée sur la figure 4c,e. La figure 4b donne un aperçu de la densité des NP HfO2 dans le cytoplasme et le noyau dans chaque section. Notamment, la densité des NP métalliques dans le cytoplasme présente des pics distincts au début et à la fin de la séquence. À l'inverse, au sein du noyau, une densité relativement plus élevée est évidente dans les sections précédant l'indice 250, tandis qu'une distribution minimale de NP métalliques est observée dans la plupart des sections au-delà de l'indice 250. De même, nous avons marqué les pics de densité de particules dans le cytoplasme et le noyau et avons représenté leurs configurations tridimensionnelles correspondantes sur les figures 4c, d. Par la suite, nous avons examiné la proportion de NP HfO2 dans chaque section par rapport à l’ensemble des NP HfO2 mesurées dans la cellule. Cette tendance est évidente sur la figure 4f, où la teneur en NP métalliques diminue progressivement à mesure que les sections s'étendent le long de l'axe z. L’enquête impliquait en outre de calculer la distance minimale entre chaque NP métallique du cytoplasme et le bord du noyau, ainsi que le bord de la cellule. La distance a été utilisée pour indiquer la profondeur de pénétration du médicament par les NP métalliques dans la cellule, comme le montre la figure 4g.

MIKI56

12 août 2024 •12:34

Figure 4. Analyse quantitative de localisation basée sur le traitement d’images numériques. (a) La teneur en NP HfO2 intracellulaires et extracellulaires est affichée pour chaque section. Les deux sections présentant la teneur en médicament intracellulaire la plus élevée sont présentées dans les panneaux (c) et (e). (b) Densité de distribution des NP dans le cytoplasme et le noyau. De même, la densité de particules la plus élevée des deux courbes est indiquée dans les panneaux (c) et (d). (f) Le rapport des NP HfO2 entrant dans la cellule par rapport aux NP HfO2 métalliques mesurées. (g) La distance minimale moyenne entre les NP HfO2 dans le cytoplasme et le bord de la cellule, ainsi que le bord du noyau, à travers chaque section.

En outre, l'absorption cellulaire unique des NP HfO2 par MCF7, B16 et HUVEC après un traitement de 12 et 24 h est déterminée par l'introduction d'une suspension unicellulaire dans la spectrométrie de masse à plasma inductif (ICP-MS). L'observation au microscope optique (Figure S12) a montré que ces cellules conservaient leur intégrité morphologique et étaient monodispersées dans une solution aqueuse, ce qui garantissait l'introduction d'une seule cellule dans l'ICP-MS. La figure S13 présente le profil temporel de 180Hf dans des cellules uniques MCF-7, B16 et HUVEC par ICP-MS. Les données montrent que le nombre d'événements unicellulaires peut atteindre environ 4 000 événements en 180 s. La fréquence relative des signaux Hf dans des cellules individuelles suit une distribution de Poisson reflétant l'hétérogénéité de l'absorption cellulaire de HfO2 NP (Figure 5). Il existe des différences dans l’absorption des NP HfO2 dans le même type de cellules, à des temps d’absorption différents et dans différents types de cellules avec le même temps d’absorption. De plus, pour le même temps d’absorption dans le même type de cellules, l’absorption des NP HfO2 par des cellules individuelles varie également. Les résultats quantitatifs (Tableau 2) montrent que l'absorption cellulaire des NP HfO2 peut atteindre 35 à 38, 25 à 28 et 27 à 38 fg 12 et 24 h après l'exposition, respectivement. L'expérience quantitative unicellulaire de l'ICP-MS a mesuré avec précision l'absorption des NP HfO2 dans différentes cellules, fournissant un support et une base de données quantitatives, et aidant à révéler les caractéristiques d'absorption des NP HfO2 dans les cellules, fournissant des indices importants pour des recherches plus approfondies sur le comportement. des NP HfO2 dans les cellules.

MIKI56

12 août 2024 •12:39

Figure 5


Figure 5. Histogrammes de Hf dans des cellules simples MCF-7, B16 et HUVEC après incubation avec des NP HfO2 à 2 nm (80 μg/mL) pendant 12 et 24 h.

2.4. Mécanisme des NP HfO2 en tant que radioamplificateurs avancés

Sur cette base, une analyse quantitative de localisation a été réalisée à quatre niveaux en utilisant l'échelle d'imagerie du Nano-CT (29,6 nm par pixel) pour évaluer les caractéristiques de volume des NP HfO2 dans l'espace tridimensionnel et leur profondeur de pénétration dans les cellules MCF-7.
L'échantillon observé du médicament HfO2 NPs présentait une division en deux parties : des groupes importants en dessous et des particules relativement dispersées au-dessus après avoir effectué une reconstruction 3D des résultats de segmentation pour toutes les tranches. Les NP HfO2 qui entraient dans la cellule, sur laquelle nous nous concentrions, étaient principalement concentrées au sommet. De plus, nous avons observé une distribution annulaire distinctive des NP HfO2 sur la section supérieure dans tout l'espace tridimensionnel, comme illustré sur la figure 6a. D'un point de vue intracellulaire, seul un segment de l'anneau HfO2 NP se trouve à l'intérieur de la cellule, comme le montre la figure 6b. Notamment, l’abondance des NP HfO2 démontre une réduction constante avec l’extension de l’axe z.

MIKI56

12 août 2024 •12:41

Figure 6


Figure 6. Visualisation de la structure 3D des cellules MCF-7 et des NP HfO2. (a) La morphologie des NP HfO2 dans la cellule. (b) Les résultats de reconstruction tridimensionnelle du modèle d'apprentissage profond montrent que les NP, le cytoplasme et le noyau sont étiquetés respectivement en jaune, bleu et vert.

D'autre part, sur la base d'une segmentation précise des composants cellulaires, nous pouvons différencier sans ambiguïté les particules biodisponibles intracellulaires de celles de l'environnement extracellulaire, ce qui est crucial pour l'administration précise des médicaments vers leurs cibles intracellulaires. On peut calculer que le volume des NP HfO2 situés à l’extérieur de la cellule était quantifié à 21,93 μm3, alors qu’à l’intérieur de la structure cellulaire, il mesurait 4,52 μm3, constituant 17,09 % de tous les NP HfO2. L'absorption des médicaments par les cellules est étroitement liée aux propriétés des médicaments, aux mécanismes d'absorption cellulaire et aux états cellulaires. Initialement, les médicaments font face à la membrane cellulaire comme une barrière lorsqu’ils pénètrent dans les cellules. Cette membrane semi-perméable régule l’entrée et la sortie des substances. Les NP HfO2, en raison de leurs caractéristiques hydrophiles, hydrophobes et biocompatibles, présentaient une absorption cellulaire relativement élevée d'environ 17,09 % (∼6,5 fg). Cela signifie qu’une partie substantielle des médicaments peut pénétrer dans les cellules et interagir avec les molécules cibles. La proportion accrue de médicaments dans les cellules MCF-7 améliore le ciblage précis des sites liés à la maladie, minimisant ainsi les dommages indus aux cellules saines. De plus, parmi toutes les NP entrant dans la cellule, 4,02 µm3 ont été trouvés dans le cytoplasme, tandis que le noyau en contenait 0,50 µm3. La distribution des NP HfO2 dans les cellules était principalement concentrée dans le cytoplasme, avec une proportion relativement plus faible, seulement 11,06 % (∼0,72 fg), atteignant le noyau. Cette distinction découle des mécanismes de transport moléculaire différents entre le cytoplasme et le noyau. Le noyau utilise des mécanismes rigoureux de contrôle des entrées et des sorties pour maintenir la stabilité du matériel génétique et de l’expression des gènes. Par conséquent, seule une minorité de NP HfO2 accède au noyau, ce qui indique le rôle du noyau dans la limitation de l’afflux et de l’efflux de NP HfO2. Cette réglementation limite la génotoxicité des NP HfO2 avant irradiation aux rayons X, soulignant la sécurité des NP HfO2. La distance moyenne, reflétant ainsi la capacité d’absorption et d’internalisation cellulaire du médicament, depuis la substance métallique dans le cytoplasme global jusqu’au bord du noyau, était de 2427,22 nm, alors qu’elle était de 710,97 nm jusqu’au bord de la cellule. Cela suggère une profondeur de pénétration modérée pour le médicament HfO2.

MIKI56

12 août 2024 •15:59

Nous avons utilisé des sphéroïdes tumoraux multicellulaires comme modèle pour examiner l’effet antitumoral des nanoparticules de HfO2. Après 9 jours de culture, les sphéroïdes multicellulaires MCF-7 développés, d'une taille d'environ 400 µm, ont été traités avec des NP HfO2. La viabilité cellulaire dans les sphéroïdes MCF-7 a montré une diminution dépendante de la dose avec une concentration accrue de NP HfO2. À une dose de 20 μg/mL de NP HfO2, une mort cellulaire de 50 % dans les sphéroïdes MCF-7 a été induite et une destruction significative des sphéroïdes accompagnée d'un rétrécissement sphéroïdal a été observée après une irradiation aux rayons X à faible dose (Figure 7). De plus, le volume de la tumeur a sensiblement diminué après une injection intratumorale de NP HfO2 combinée à une irradiation aux rayons X à faible dose par rapport au contrôle (Figure 8). L'analyse quantitative de Hf in vivo par ICP-MS montre que les NP HfO2 persistaient dans la tumeur au jour 7 après l'injection intratumorale. L'analyse d'imagerie 3D SR-μCT a également clairement démontré une diffusion substantielle des NP HfO2 dans les tissus tumoraux, indiquant une augmentation marquée de la pénétration de la tumeur et de la zone de distribution dans les tumeurs au jour 7 après le traitement par irradiation aux rayons X à faible dose.

MIKI56

12 août 2024 •16:01

Figure 8. Effets thérapeutiques des NP HfO2 sur la tumeur MCF-7. (a) Effets des NP HfO2 sur la croissance du cancer du sein au jour 7 après l'injection intratumorale après 3 traitements d'irradiation aux rayons X de 3,7 Gy. (b) Variation du volume tumoral au fil du temps après injection intratumorale de NP HfO2. (c) Biodistribution des NP HfO2 in vivo au jour 7. (d) Scans SR-μCT pour la visualisation de la distribution interne des NP HfO2 dans les tumeurs au jour 7.

Enfin, les résultats de la distribution intracellulaire des médicaments (Figure 4c) démontrent que les NP HfO2 peuvent pénétrer en profondeur dans le volume 3D de la cellule d'un bout à l'autre dans une certaine dimension. Nous pensons que la capacité des NP HfO2 à présenter une bonne perméabilité au sein de tissus tumoraux de plusieurs millimètres (Figure 8d), ainsi que leur efficacité démontrée dans le traitement des tumeurs (Figure 8a), peuvent être potentiellement corrélées au phénomène observé au niveau cellulaire. niveau, où les NP HfO2 peuvent pénétrer complètement d’une extrémité à l’autre de la cellule et avoir une rétention suffisante dans la cellule après la pénétration. En effet, les nanomédicaments anticancéreux efficaces doivent s’accumuler, se distribuer et s’infiltrer efficacement dans les tumeurs pour exercer leurs effets thérapeutiques. (34) Cependant, le mécanisme sous-jacent spécifique de cette corrélation reste inconnu et nous pensons qu'il pourrait être lié aux propriétés de dynamique des fluides, aux mécanismes de transport cellulaire et aux propriétés chimiques de surface des NP HfO2.

MIKI56

12 août 2024 •16:04

Limites de l'étude
Dans cette étude, il existe encore certaines limites dans l’analyse quantitative par imagerie tridimensionnelle des nanoparticules dans les cellules cancéreuses à l’aide du Nano-CT assisté par CSUNet. L’une est l’application spécifique de modèles d’apprentissage profond basés sur les données d’imagerie Nano-CT actuelles. En effet, l’hétérogénéité inhérente des populations cellulaires nécessite une imagerie à haut débit pour capturer avec précision la diversité au sein des échantillons cellulaires. Cependant, cela n’est pas pratique avec le Nano-CT en raison de contraintes de temps et de coûts. De plus, bien que la Nano-CT soit efficace pour différencier les composants cellulaires, elle présente une limite dans l’analyse précise des composants multiples ou des nanomédicaments (ND) chimiquement modifiés, comme les ND d’or et d’argent. Cela est principalement dû au fait qu’elle repose sur une imagerie basée sur le contraste, qui peut ne pas fournir une différenciation suffisante dans de tels cas. Malgré ces limites, cette méthode a montré une évolutivité et un potentiel prometteurs dans l’analyse et la quantification des distributions de nanoparticules intracellulaires. Avec l’imagerie de grandes populations cellulaires à l’avenir, cette approche automatisée pourra traiter efficacement de grands ensembles de données. Les travaux futurs se concentreront sur l’amélioration du réseau de segmentation afin de traiter plus efficacement les tâches de segmentation complexes et d’intégrer des méthodes d’analyse statistique complètes, telles que la spectrométrie de masse.

MIKI56

12 août 2024 •16:07

4. Conclusions
La délivrance intracellulaire efficace de nanoparticules pour exercer un effet destructeur est un problème extrêmement important dans le domaine de la délivrance de nanomédicaments. En particulier, les particules ultrapetites ont montré d’excellents avantages pour pénétrer dans les cellules par endocytose, transport et mouvement de déformation de la membrane cellulaire. Cependant, le manque de technologies d’analyse quantitative subcellulaire capables de fournir une analyse à haute résolution et de localisation spatiale a empêché une enquête complète et quantitative sur la délivrance subcellulaire de NP. Pour comprendre les mécanismes qui sous-tendent les actions des médicaments dans les cellules tumorales, il est impératif d’observer la distribution et la localisation des ND dans les cellules. Nous avons conçu un pipeline modulaire et automatisé pour l'analyse quantitative à partir d'images CT, basé sur la classification et la segmentation des images par apprentissage profond. Il peut répondre efficacement aux demandes actuelles d’analyse à haut débit et aux défis posés par les pièges potentiels de l’analyse manuelle. Autrement, par rapport à la méthode d’analyse quantitative de localisation de la spectrométrie de masse, notre méthode d’image est basée sur les données d’image collectées par Nano-CT, réduisant ainsi la dépendance de l’analyse quantitative de localisation sur la quantité d’échantillon. Cette approche innovante segmente avec précision un large éventail de composants cellulaires, en commençant par les images Nano-CT de cellules individuelles. Surtout pour les NP ultrapetites qui sont présentes en quantités infimes au niveau intracellulaire. Grâce à cette technique, nous avons efficacement discriminé l’espace extracellulaire, le cytoplasme, les NP et le noyau à l’aide d’un codage couleur à contraste élevé. De plus, il fournit des résultats quantitatifs de localisation concernant les composants cellulaires basés sur l’échelle d’imagerie (29,6 nm par pixel). La pénétration plus profonde des NP HfO2 dans le tissu tumoral et l’absorption plus élevée des cellules tumorales fournissent une explication mécaniste des excellents effets thérapeutiques des radioamplificateurs. Ces découvertes ont des implications potentiellement importantes pour la conception des NP de ciblage subcellulaire, en fournissant notamment une méthode quantitative de localisation efficace pour les NP de très petite taille de particules dans le traitement des tumeurs.

MIKI56

12 août 2024 •16:14

En conclusion, outils de contrôle et d’analyse intéressant par rapport aux études manuelles.

NANO3

12 août 2024 •18:17

Après de telles informations, ne faut-il pas reprendre les essais à zéro pour les prendre en compte?!...