Réponse à Luca L Fava et ses collègues
Nous avons lu avec beaucoup d'intérêt la lettre de Fava et de ses collègues, qui contestent les conclusions de notre article publié dans EMBO Reports (2013) 1 . Nos travaux ont décrit le rôle de Beclin-1 dans la congression des chromosomes et l'assemblage des kinétochores externes. Nous avons démontré que ce rôle inattendu de Beclin-1 est indépendant de son association avec le complexe PI3K-III et de son rôle bien documenté dans l'autophagie. Nos résultats étaient basés sur le renversement de Beclin-1 à l'aide de deux ARNsi différents et sur des expériences de sauvetage. Des expériences supplémentaires de biologie biochimique et cellulaire avec des protéines natives ont également suggéré un rôle fonctionnel pour Beclin-1 dans l'assemblage du kinétochore externe.
Dans ce numéro de EMBO Reports , Fava et ses collègues suggèrent que Beclin-1 est dispensable pour la congression chromosomique. Ils ont réalisé une série d'expériences avec deux ARNsi supplémentaires ciblant Beclin-1. L'un d'eux détruit efficacement Beclin-1 au niveau des protéines (siRNA Becn1-II); le second n'épuise que partiellement Beclin-1 (siRNA Becn1-I). Ils rapportent dans leur étude que, contrairement à ce que nous avons décrit, aucun traitement n'affecte la progression mitotique dans leur analyse des cellules vivantes. Ils n'ont trouvé aucun retard dans la congression des chromosomes. Cependant, en utilisant l'un de nos siRNA ciblant Beclin-1 (nommé siRNA Becn1-ER dans leur rapport et siRNA Beclin-1 dans notre article), Fava et al.a confirmé nos observations: la déplétion en beclin-1 affecte le ciblage de plusieurs protéines kinétochores externes, retarde la congression chromosomique et entrave la progression par mitose. Fava et ses collègues concluent cependant que le phénotype est dû à un effet hors cible de notre ARNsi.
Malgré les écarts avec nos résultats, nous sommes confiants dans nos données pour plusieurs raisons:
Un deuxième siRNA (appelé siRNA Beclin-1 (# 2)) dans notre article a donné des résultats similaires à ceux obtenus avec le siRNA Becn1-ER (voir Figure supplémentaire S1 dans notre article de Frémont et al 1 ).
Une lignée cellulaire HeLa exprimant de manière stable une construction (HA) -Beclin-1 résistante au siRNA a partiellement sauvé le phénotype d'appauvrissement de Beclin-1 en ce qui concerne la progression mitotique (le sauvetage des autres phénotypes attribués à Beclin-1 n'a pas été évalué), en faisant valoir contre un effet hors cible du siRNA. En examinant cette expérience dans notre article, Fava et al.remarque: «Lors du renversement de Beclin-1, [cependant], les deux lignées cellulaires montrent une augmentation de plus de deux fois des cellules G2 / M par rapport au contrôle. Cela montre en fait que l'ARNsi Becn1-ER déclenche la même augmentation relative des cellules G2 / M dans les deux lignées cellulaires étudiées et que cet effet n'est pas empêché par l'expression de HA-Beclin 1 résistant à l'ARNi. » Cependant, nous avons analysé nos résultats différemment. Nous avons déclaré que l'expression ectopique de siRNA-résistant (HA) -Beclin-1 sauve partiellement (35%) l'accumulation de cellules à contenu ADN 4n. Nos conclusions étaient basées sur le calcul du rapport des cellules avec une teneur en ADN 4n (cellules G2 / M) aux cellules avec des cellules en ADN 2n (cellules G0 / G1) dans chaque condition expérimentale. Les rapports obtenus dans les cellules appauvries pour Beclin-1 ont été comparés à ceux obtenus pour les cellules témoins siRNA dans chaque lignée cellulaire.
Plus important encore, notre article et le rapport de Fava conviennent que le traitement par siRNA Becn1-ER conduit à une augmentation du temps écoulé entre la rupture de l'enveloppe nucléaire (NEBD) et l'anaphase. La gravité de ce phénotype dépend de la concentration de siRNA Becn1-ER transfecté dans les deux études (voir Fig 2H dans notre article et Fig 1G dans le rapport de Fava). Cependant, comme ce phénotype n'était pas corrélé avec le niveau de Beclin-1 détecté par Western blot dans Fava et al., ils concluent que le phénotype induit par siRNA Becn1-ER est un effet hors cible (figure 1F). En revanche, dans notre article, la concentration de siRNA transfecté est en effet inversement proportionnelle au niveau de Beclin-1 détecté par Western blot et au nombre d'événements mitotiques corrects observés. Bien que le knockdown de Beclin-1 avec siRNA Becn1-II semble aussi efficace que l'appauvrissement induit par la transfection siRNA Becn1-ER (voir Fig supplémentaire S1B), comparaison quantitative de l'efficacité de la déplétion de Beclin-1 avec ces siRNA (Becn1-II et Becn1 -ER) au niveau des protéines doit être effectué en tête-à-tête pour réconcilier ces données contradictoires.
Malgré la recherche dans les bases de données (Blastn et RNA plex) et les expériences transcriptomiques, Fava et al n'ont pas pu identifier un candidat hors cible «fumant» qui pourrait expliquer les écarts entre notre article et leur rapport.
En plus du phénotype de progression mitotique du traitement siRNA, nous avons également montré que Beclin-1 s'associe aux microtubules kinétochores et forme des foyers discrets au niveau des kinétochores des chromosomes attachés. De plus, nous avons également identifié une interaction directe entre Beclin-1 et la protéine kinétochore externe Zwint-1 (précédemment rapportée par Behrends et ses collègues 2 ), un composant du complexe KMN (KNL-1 / Mis12 / Ndc80) qui est essentiel pour le kinétochore- interactions des microtubules et congression des chromosomes. Ces résultats sont cohérents avec le phénotype de nos études d'ARNsi et plaident en faveur d'un véritable rôle de Beclin-1 dans la congression chromosomique.
Pris ensemble, la collecte de données et de contrôles dans notre article soutient le rôle de Beclin-1 dans la progression de la mitose. Le rapport de Fava et al révèle comment le traitement de l'ARNsi peut avoir un effet généralisé sur les transcriptions cellulaires, mais il n'aborde pas la fonction de Beclin-1 dans l'assemblage du kinétochore.
