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Retour au sujet CELLECTIS

CELLECTIS : Prochaine cible cellectis - le foie ?

joella
01 sept. 201706:55

Choulika s'est exprime récemment en itw sur la plus grande facilite de soigner les maladies du sang (leucémies, mais pas seulement), de l'oeil et du foie.. (que d'autres). et cette invention de cellectis décrit les procédés qui peuvent conduire a guérir un paquet de maladies du foie.

Donc la ils fournissent 2 exemples de soins que l'invention peut apporter... parmi une foule d'autres soins du foie. Choulika a indique que la prochaine therapie (sans doute celle de 2018) correspondrait a de l'ecretage de virus... il y a des chances qu'il s'agisse du virus de l'hépatite B (HBV).

Et par ailleurs, l'invention recouvre un ensemble de maladies candidates pour la thérapie génique du foie qui incluent des maladies du foie primaires dans lesquelles des hépatocytes sont blessés et des défauts génétiques altérant une fonction spécifique de l'hépatocyte mais provoquant des manifestations extra-hépatiques.
Des tests murins de cellectis démontrent les corrections.



WO2017144630 - ENCAPSULATION NUCLÉASE DANS UN SYSTÈME À BASE DE MICELLES DESTINÉE À L'ÉDITION DE GÈNE IN VIVO

DUCHATEAU, Philippe; ZENNOU, Veronique

La présente invention décrit des thérapies qui nécessitent l'édition de gène (tous les outils sont cites, crispr, doigts de zinc, Talens...), et plus spécifiquement des procédés non viraux destinés à l'administration in vivo de réactifs endonucléases à des tissus ou des cellules spécifiques. Selon l'invention, les réactifs endonucléases sont encapsulés dans des structures de micelles de 50 à 150 nm de diamètre pour l'injection intraveineuse. L'invention décrit ainsi une composition thérapeutique comprenant de telles structures de micelles, par lesquelles les réactifs endonucléases peuvent être administrés dans la cellule sous la forme d'ARN pour leur utilisation dans le traitement de maladies liées à un gène.

Les capsules de délivrance sont particulièrement appropriées pour une injection intraveineuse pour cibler des séquences génétiques endogènes dans les cellules.

La présente invention revendique des compositions pharmaceutiques comprenant les capsules de délivrance biodégradables dans des traitements impliquant des réactifs d'endonucléase.

De tels traitements peuvent faire partie d'une thérapie génique pour lesquelles des séquences génétiques spécifiques doivent être éliminées ou réparées, d'une thérapie anti-infection, en ciblant le génome d'agents infectieux oud'une thérapie contre le cancer.

Les capsules de délivrance biodégradables de cette invention se sont révélées particulièrement adaptées pour traiter des agents infectieux qui présentent un ADN intermédiaire dans les cellules du foie, telles que l'ADNc ccc (ADN circulaire fermé de manière covalente) du virus de l'Hepadnavirus, en particulier le VHB (virus de l'hépatite B) qui sont des formes résistantes de ces virus logés dans les hépatocytes.

***

A titre d'exemple, parmi d'autres, realise sur les souris, il y a ceci...

***

Conception de TAL-nucléases ciblant les sous-types de VHB cccDNA

Le virus de l'hépatite B (HBV) est un membre de la famille de virus de l'hépatite Alviridae. L'infection par le VHB peut entraîner une cirrhose et un carcinome hépatocellulaire. Le génome du VHB est constitué d'un ADN circulaire, qui n'est pas entièrement double brin. Une extrémité du brin de longueur totale est liée à l'ADN polymerase virale. Le génome mesure 3 000 nucleotides (pour le brin de longueur totale) et 2 000 nucleotides (pour le brin court). L'ADN partiellement bicaténaire est totalement bicaténaire par l'achèvement du brin de détection (+) et l'élimination d'une molécule de protéine à partir du brin de détection (-) et d'une courte séquence d'ARN du brin de détection (+). Les bases non codantes sont retirées des extrémités du brin de détection (-) et les extrémités sont rejointes. Il existe quatre gènes connus codés par le génome, appelé C, X, P et S. La protéine de noyau est codée par le gène C (HBcAg), et son codon de départ est précédé d'un codon de départ AUG en amont dans le cadre de laquelle la protéine pré-noyau est produite. HBeAg est produit par traitement protéolytique de la protéine pré-noyau. L'ADN polymérase est codée par le gène P. Le gène S est le gène qui code pour l'antigène de surface (HBsAg). La fonction de la protéine codée par le gène X n'est pas entièrement comprise, mais elle est associée au développement du cancer du foie. Il stimule les gènes qui favorisent la croissance cellulaire et inactive les molécules régulatrices de la croissance.

Le cycle de vie du virus de l'hépatite B est complexe. L'hépatite B est l'un des quelques pararetrovirus connus: les non-rétrovirus qui utilisent encore la transcription inverse dans leur processus de réplication. Le virus gagne à entrer dans la cellule en se liant à NTCP à la surface et en endocytose. Parce que le virus se multiplie via l'ARN réalisé par une enzyme hôte, le virus de l'ADN génomique doit être transféré au noyau cellulaire par des chaperons cellulaires. L'ADN viral partiellement double brin est alors complètement bicaténaire par polymerase virale et transformé en ADN circulaire fermement fermé (cccDNA). Ce cccDNA sert de modèle pour la transcription de quatre ARNm viraux par ARN polymérase hôte. Le plus grand ARNm, (qui est plus long que le génome viral), est utilisé pour fabriquer les nouvelles copies du génome et pour fabriquer la protéine du noyau de capside et l'ADN polymérase virale. Ces quatre transcrits virales subissent un traitement supplémentaire et continuent à former des virions de progéniture qui sont libérés de la cellule ou sont retournés au noyau et recyclés pour produire plus de copies. L'ARNm long est ensuite transporté vers le cytoplasme où la protéine P de virion (l'ADN polymérase) synthétise l'ADN via son activité de transcriptase inverse.

Le but du projet était de générer des TAL-nucléases capables de couper l'ADNc du VHB et de diminuer son niveau dans la culture cellulaire et in vivo. Il devrait également couper l'ADN circulaire décontracté (ADN RC), agissant ainsi sur deux pools différents de virus. Il pourrait également réduire les génomes partiels intégrés du VHB qui se retrouvent le plus souvent dans les hépatocarcinomes.

Il n'y a pas d'inhibiteurs connus de l'ADNccc. Certains inhibiteurs prétendent inhiber la formation de l'ADNc ccc, mais aucun ne cible le pool de réservoir épisomique durable du VHB chez les patients. La destruction de ce bassin pourrait être un outil pour la guérison du VHB.

Le génome du VHB est difficile à exprimer dans la ligne des cellules en raison de la complexité de son processus de réplication et de sa toxicité. En outre, les cellules qui produisent du VHB sont difficiles à transfettre. Nous décidons donc de générer une lignée cellulaire stable dans 293 cellules contenant un génome HBV de référence (ayw) intégré à un locus connu en utilisant une approche cGPS comme décrit dans WO2010046786, de sorte que l'activité des réactifs d'endonucléase puisse être surveillée de manière simple et non infectieuse.

Les cellules HBV HEK 293 ont été très utiles pour sélectionner des cibles efficaces de TALE-nucleases

HBV. Les cellules M1 -1000, M801-1800 et M1601 -2006 ont été utilisées pour tester les TALE-nucléases: TALEN T002559-2564 (ensemble 1) et TALEN T001212-1215 (set2). Tous ont pu réduire leur cible, avec un niveau d'efficacité différent. Nous avons pu générer au moins un TALEN par gène très efficace.

PCR sur cGPS transfectés

L'activité des TALENs ci-dessus a été mesurée en transfectant des plasmides dans les cellules cGPS VHB 293 ci-dessus. 1,5 million de chaque type de cellules HBV cGPS HEK 293 ont été plaquées en T25 le soir avant la transfection. 2 ?g de chaque ensemble de plasmides appropriés (donc 4 ?g par TALEN, voir tableau 1 et tableau 2) ont été transfectés en utilisant le réactif de transfection Mirus TranslT-293 pendant 3 à 4 jours. Un contrôle GFP a été transfecté en parallèle (4 ?g) pour toutes les lignées cellulaires et l'efficacité de la transfection a été surveillée avec un microscope fluorescent et estimée à -95%. L'ADN génomique a ensuite été extrait en utilisant le kit de miniprep à rapide-gDNA de Zymo Research et la PCR.

Test d'endonucléase T7 sur des cellules cGPS de HBV transfectées avec des TALEN

Les produits de PCR ont été recuits lentement, traités par l'endonucléase T7, exécutés sur un gel de polyacrylamide à 10% et colorés avec Sybergreen (dosage T7). On s'attend à ce que la réparation de TALEN et NHEJ aboutisse à la formation d'une population

***
Autre exemple

Ciblage in vivo du gène du facteur VII dans le génome des cellules du foie

Le foie est un organe clé pour la plupart des voies métaboliques et, par conséquent, de nombreuses maladies héréditaires métaboliques ont leur origine dans cet organe. C'est une cible attrayante pour les études de transfert de gènes in vivo en raison de l'accessibilité des hépatocytes par la circulation sanguine. Le foie est le plus grand organe du corps et un organe hautement vascularisé. C'est le seul organe du corps à disposer de deux systèmes de circulation, systémique avec l'artère hépatique qui apporte du sang oxygéné directement du cœur et la veine porte qui apporte des nutriments provenant de l'intestin et fournit 70% du flux sanguin au foie. En outre, il dispose d'un système de conduits qui transporte les toxines hors du foie via la bile dans l'intestin grêle, ce qui est important pour les applications de thérapie génique du foie car il permet aux hépatocytes d'excréter les sels biliaires, le cuivre, la bilirubine, etc. maladies.

Les maladies candidates pour la thérapie génique du foie incluent des maladies du foie primaires dans lesquelles des hépatocytes sont blessés et des défauts génétiques altérant une fonction spécifique de l'hépatocyte mais provoquant des manifestations extra-hépatiques.

En tant que preuve de principe, le foie a été choisi comme organe cible en raison de l'inactivation du facteur VII de souris in vivo. Le facteur VII de la souris est une protéine sécrétée sécrétée par des cellules du foie, qui peut être facilement quantifiée dans le sang. L'inactivation du gène dans le foie de souris devrait conduire à une diminution de la protéine sécrétée dans le sang circulant comme décrit ailleurs (Akin, A. et al. (2009) Développement de formulations de Lipidoid-siRNA. Molecular Therapy 17 5: 872- 879.)

Les TAL-nucleases ont été manipulées au niveau de l'ADN en utilisant la méthode d'assemblage de clonage à grille dorée décrite par Weber E. et al. (Assembly of Designer TAL Effectors par Golden Gate Cloning (201 1) PLoS ONE 6 (5): e19722) et cloné dans un vecteur d'expression de mammifère sous le contrôle d'un promoteur alpha alpha de pEF1 et testé dans une lignée cellulaire humaine en utilisant un T7 expérimenter comme décrit dans l'exemple 1.

Les transcrits d'ARNm encodant respectivement vers l'avant (SEQ ID NO: 21 ou 23) et inversé (SEQ ID NO: 20 ou 22) des paires de monomères TALEN les plus efficaces ont été produits en utilisant un procédé standard (Ambion kit, Thermo Fisher Scientific). Les transcrits coiffés ont été complexés avec des lipides 1, 2-dilinoleyloxy-3-diméthylaminopropane (DLinDMA) cationiques ionisés et des lipides de PEG pour générer des nanoparticules de la gamme de diamètre de 80 nm pour une administration systémique au foie.

Les contrôles étaient PBS (contrôle négatif) et siRNA contre le facteur VII (contrôle positif de Ambion, # 4457292 Thermofisher), car l'ARNsi avait une efficacité éprouvée dans des études antérieures.

Le volume d'injection était de 10 ml / kg (c'est-à-dire pour une souris pesant 20 g, 200 ?l de solution de dosage est administrée). L'injection était de 2 mg / kg, d'une solution de 0,2 mg / ml, de sorte que 200 ?l ont été injectés pour une souris 20 g, par voie intraveineuse (IV, bolus) dans la veine caudale des souris.

Le traitement commence le jour 0 (D0) en utilisant seize (18) souris CD-1 féminines saines.

Le calendrier de traitement est le suivant:

Les animaux du groupe 1 ont reçu une seule injection intraveineuse de tampon témoin (Q1 Dx1)

Les animaux du groupe 2 ont reçu une seule injection IV d'ARNm TALEN® complexé en capsules à 2 mg ARN / kg (Q1 Dx1),

Les animaux du groupe 3 ont reçu une injection intraveineuse IV de contrôle positif de siRNA (siRNA FVII) à 2 mg / kg (Q1 Dx1).

Le sang a été recueilli sur DO (juste avant le traitement IV) puis sur D3, D5, D10, D15, D20 et D25. Toutes les souris ont pris fin le D25. Environ 150-200 ?l de sang ont été recueillis à chaque point de temps, le plasma a ensuite été congelé dans de l'azote liquide et conservé à -80 ° C. Le foie de chaque souris a été recueilli au moment de la terminaison, gelé dans l'azote liquide et conservé à -80 ° C.

L'activité du facteur VII dans le plasma recueilli a été mesurée en utilisant le kit BIOPHEN FVII n ° 221304.

Les modifications des gènes ont été mesurées dans les foies en extrayant l'ADN génomique sur du foie congelé en poudre en utilisant ZR Genomic DNA (TM) -Tissue MidiPrep de ZymoResearch # D31 10, puis en effectuant un dosage T7 et un séquençage profond sur le produit de PCR du lieu d'intérêt.

Les résultats montrent à la figure 5 que l'on obtient un effet plus rapide avec siRNA par D3 à D10. Cependant, par D15, le siRNA commence à diminuer, alors que l'inhibition induite par l'administration de TALE-nucléases reste stable jusqu'à D20. Avec les résultats du séquençage profond (données non représentées), il semble que l'inhibition stable observée avec les TALE-nucléases soit due à des mutations conférant une inactivation permanente d'un grand nombre de copies de gènes du facteur VII dans les cellules du foie.

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30 réponses

  • clank30
    01 septembre 201707:41

    nan nan , prochain objectif : LA LUNE

    cordialement

    bonne journée

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  • M847654
    01 septembre 201708:45

    Le brevet que vous cite WO2017144630 a ete publié le 31 aout. Et je pense que vous le mentionnez opportunément suite au post original de Chris76 hier soir qui indique 2 nouveau brevet.Il aurait ete plus elegant de rebondir sur sa fille. Merci a Chris76 pour sa veille.

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  • M7163258
    01 septembre 201708:59

    Merci à Joella et à tous ceux qui apportent des informations sur Cellectis ! L'élégance c'est, à mon avis, de remercier tous ceux qui participent positivement sans s'attarder sur les détails de ressentiments personnels ...

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  • M847654
    01 septembre 201709:06

    Non elle désinforme
    Cf post scoop sur 2 nouveaux nourissons supplémentaire sauve au Gosh.
    L information est donner par Chris76 sur les brevet.
    Je n ai aucun ressentiment personnel.
    Je ne supporte pas ces post caviarde après a vous de gober ou pas.

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  • M7163258
    01 septembre 201709:14

    Aigri!

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  • clank30
    01 septembre 201709:15

    m847 attention a l'ortograf

    il aurait t plus lgant de rebondir sur sa fille , euh il en a une ??

    il va pas etre content le chris je pense

    fille = file sa sera mieux, quoique faut voir le morceau

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  • M5649485
    01 septembre 201709:16

    l'important étant que l'information circule sur ce forum Joella et Chris etc y participent pour beaucoup
    néanmoins pour le "scoop" M847 n'a pas tort, Joella avait elle même qqs doutes puisqu'elle avait pris la précaution de mettre un point d'interrogation sur son post tête de file mais cela n'avait rien d'un scoop effectivement .

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  • joella
    01 septembre 201709:18

    l'élégance c'est d'ouvrir la porte soit même, et pas de demander a l'autre de le faire... je préfère te boursignorer M847654... mais tu constatera sans mal que cela ne te retire pas le droit a la parole... chacun reste libre de médire, d'analyser, de réfléchir, de jalouser, de partager, d'échanger, de critiquer et d'insulter... et de boursignorer.

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  • M7163258
    01 septembre 201709:22

    " a vous de gober ou pas." j'ai acheter du Cellectis à 3.4 euros grâce à joella! Alors qu'une valeur subit des écarts ensuite, c'est la bourse! J'ai effectué des aller et retours pas tous frutueux mais globalement très positif! Personne n'est obligé de prendre à la lettre les informations où d'en tirer immédiatement des impératifs à l'achat ou la vente...

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  • M7163258
    01 septembre 201709:23

    "ou"

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  • joella
    01 septembre 201709:26

    merci a chris de faire remonter plein d'infos, merci a tous ceux qui partagent... quant a moi j'essaye de comprendre ce que je peux, ensuite je partage que ca plaise ou non... et bien sur j'en suis a faire des hypothèses. Cellectis depose beaucoup de brevets, certains ne donneront pas de soin tout de suite, mais Choulika a été clair, ce n'est pas une invention de ma part, il y aura une autre therapie cellectis en 2018 autre que les CAR T et cela tres probablement de l'ecretage de virus dans l'ADN... avec les Talens... mais éventuellement aussi un renforcement des défenses immunitaires humaines contre les infections... cela peut venir du brevet tous NK depose par cellectis. oui, je cherche et je partage, si cela ne vous plait pas, il y a d'autres biotechs.

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  • M847654
    01 septembre 201709:47

    @71
    helas non je suis pas aigri , je ne suis un petit joueur par rapport a certain . 100 titre cellectis ... la honte

    Mais parlez d'information pas de desinformation .

    Quand on travesti sciemment une traduction ( cf post ZScoop Gosh Veys Qasem ) post Celelctis VS Novartis ..

    Quant on omet sciemment de preciser de quelle chimio il est question dans le post "la chimio terapie dissemine le cancer " etc etc .. ce n'est plus de l'information ..
    Quand ce meme post a pour origine un charlatan notoire au US . Mike Adams . ce n'est plus de l'information
    Mettez vous a la place d'un malade ou d'un parent de malade qui suit une chimio .
    "Eh maman arête tout tu va chopper le crabe partout avec ta chimio "
    .... alors qu'en lisant l'article en Anglais on s'apercoit que l'etude ne porte quee sur la chimio neo adjuvante (qui on le sait peut etre destuctrice )

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  • M5649485
    01 septembre 201709:52

    il n'y a vraiment aucune honte à avoir 100 titres (50 ou même10) chacun fait avec ses moyens ...c'est de penser le contraire qui serait honteux ..

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  • M847654
    01 septembre 201711:20

    Non ce ne sont pas des petite faute.des erreurs ...
    C est de la désinformation .
    Je n'ai cite que les exemples récent

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  • nene777
    01 septembre 201714:47

    http://www.ina.fr/video/I12044399

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  • joella
    01 septembre 201714:52

    merci de chercher a me comprendre jmlhomme

    Edouard Balladur "Je vous demande de vous arrêter", ok, nene777... jusqu'a la prochaine...

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  • nene777
    01 septembre 201714:58

    ... le brouhaha (la bagarre) !

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  • M7163258
    01 septembre 201715:14

    M8476 "Lorsque le sage désigne la lune, l'idiot regarde son doigt"

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  • M847654
    01 septembre 201716:00

    vous pouvez sortir toutes les citations litteraire et poetiques du monde :) . ca jette en soirée surement
    a chaque fois que le lirais une enormité logique ou scientifique voire une inelegance :) et dans la measure de mon temps disponible je le ferais
    ( la plus top etant la chimio qui dissemine le cancer quand meme ces dernier temps , faut le faire )

    .. allez une petite ancienne .. avant la prochaine qui ne serais tarder ...
    post du 16.08 2017 / penurie de patient en Oncologie .. ce qui explique les problem rencontré par cellectis
    Le tout sur un ton affirmatif qui ne laise place au doute ..bingo .. 2 reco sur ce post quand meme .

    mais je vois deja une enormité sur une autre file sur le post "article du Dr Damien Mascert " .. qui orienterons deja certains admirateurs naïf ...

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  • M847654
    02 septembre 201713:39

    Bonjour Jlhomme , oui qui donc aurait effacé votre post ? heureusement que vous l'avez retrouvé .
    Ne serais pas quelqu'une qui ne souhaiterais pas ce post remonte a la surface ? (je crains ques si )
    gardez le donc avant qu'il ne disparaisse encore

    Donc vous me demandez pourquoi je ne cite pas cette enormité .
    Vous avez raison car c »'est surement l'enormité de la semaine voir du mois .. de l'année .
    je ne l'ai pas fait car un autre forumeur contrariant comme moi l'a fait . bon il n'a recu aucune reco evidemment ni de bravo , merci , grace a toi ..

    Donc cette enormité est la suivante : du 01.09.2017 a 14:21 . Article Du docteur Damien
    Post de Joella "avec cellectis le prix sera divisé par 10 , il feront le vaccin avant la chimio .. "

    1 ere Remarque :( Mais cela a deja éte note par le forumeur contrariant .'( ce n'est pas ce qui a été fait lors de la guerison des 2 bebes . c'est l'inverse qui a été fait . Traitement clasique (chimio ) qui a occasionné des rechutes puis injectionde CART

    2 eme Remarque : de facon protocolaire dans les cas de leucemie et autre cancer on essaye d'abord les traitement classique (heureusement que certain marche quand meme , mois couteux ) et seulement en cas de recidive ou resistance on passé on traitement CART .

    Andre Choulika
    " ce produit, une fois "mis sur étagère", sera administré uniquement lorsque les médecins en auront besoin",

    https://www.sciencesetavenir.fr/sante/cancer/leucemie-le-traitement-genetique- fait-ses-preuves_29728

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  • joella
    14 septembre 201717:17

    deja etudie ici
    YVESTOU

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  • joella
    17 novembre 201714:34

    up, mais faut que je retrouve l'itw de choulika

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  • YVESTOU
    17 novembre 201715:12

    quand je regarde tous ces brevets clés publiés par CELLECTIS , je me dis que ce n'est pas forcément un gros labo comme PFIZER qui peut lancer une OPA sur CLS . THERMO FISHER ( avec laquelle , d'ailleurs , CLS a un accord croisé sur les brevets ) pourrait tout à fait être intéressé par la capacité des équipes de CLS à développer des brevets liés aux techniques de modification des gènes en général ....

    DONC : de possibles surenchères ....

    Franchement : le cours actuel me semble être une des toutes dernières opportunités pour acquérir à bon compte du CLS .

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  • Junome78
    17 novembre 201715:18

    Bonjour,
    Dans le cadre d une eventuelle opa, qui aurait les moyens financiers pour jouer les encheres faces a Pfizer ?
    Eventuellement Novartis. Non, car ils lorgnent Celyad.
    C est plie pour moi.

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  • joella
    17 novembre 201715:53

    cote puissance de feu, Pfizer est imbattable, mais de toute façon;

    - pfizer détient 8%
    - Pfizer détient 15 cibles CAR T sur 33

    Pour un autre concurrent, ca va etre dur de lutter

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